潔凈室質(zhì)量控制及其檢測(cè)方面的討論

潔凈室對(duì)于制藥工業(yè)的重要意義已為人們肯定。生物制品 是制 藥工業(yè)的一部分，對(duì)生產(chǎn)廠房有很高的潔凈要求^［1，2］。Gilland等曾在市售的 嗜酸乳桿菌產(chǎn)品中，分離到人為污染的短乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌等^［3］ 。生物制品生產(chǎn)中，尤其是活菌、活疫苗的生產(chǎn)中，經(jīng)常受到不同程度的污染，因此，不僅 需要重視潔凈室的建立，更要重視質(zhì)量控制方法及標(biāo)準(zhǔn)。

　　朝鮮戰(zhàn)爭(zhēng)中，美國(guó)發(fā)現(xiàn)大量電子儀器失靈，zui后找到了主要原因，是灰塵在作怪，促成了潔 凈技術(shù)的起步。1961年，誕生了世界上zui早的潔凈室標(biāo)準(zhǔn)，既美國(guó)*技術(shù)條令203，1963 年，頒布了上zui的潔凈室標(biāo)準(zhǔn)：美國(guó)聯(lián)邦FS209。1966年，頒布了修訂后的209A， 時(shí)至1992年，建立了迄今被廣泛采用的209E。上為了加強(qiáng)藥品、生物制品質(zhì)量管理規(guī)范 （GMP），把潔凈室定為*的生產(chǎn)硬件之一。GMP對(duì)廠房、設(shè)備等，明確規(guī)定了相應(yīng)的潔凈要 求，并制訂了有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

　　1　潔凈室的污染源

　　潔凈室污染源按性質(zhì)可分物理、化學(xué)、生物等。直徑在0.001-1000μm的固態(tài)、液態(tài)或二者 的混合物質(zhì)，包括生物粒子和非生物粒子，我們稱為懸浮粒子（airborne particles）。微生 物一般以無(wú)生命的粒子作載體而懸浮，以氣溶膠（Aerosol）形式存在于空氣中，1μm以下 者永外懸浮，10μm以上者會(huì)逐漸沉下來而形成菌塵。潔凈室污染可分為外部污染和內(nèi)部污 染。外部污染指大氣塵污染，可以通過光電法測(cè)得。內(nèi)部污染，是由人和有關(guān)的物品、設(shè)備 等引起的。人是潔凈室zui大的污染源，占90%左右。人和環(huán)境造成了潔凈室的污染，所以在 潔凈室中，人的數(shù)量和活動(dòng)應(yīng)有特別嚴(yán)格的限制。一般男性每人每分鐘向周圍排放1000個(gè)以 上的含菌粒子，女性為750個(gè)以上。穿衣服時(shí)，靜止態(tài)發(fā)菌量為10-300個(gè)/min·人，行走時(shí) 的發(fā)菌量為900-2500個(gè)/min·人。咳嗽一次發(fā)菌量為70-700個(gè)/min·人，噴嚏一次為400-60 0個(gè)/min·人^［4，5］。

　　2　潔凈室質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

表1　世界主要國(guó)家潔凈室標(biāo)準(zhǔn)（潔凈度級(jí)別）

　　 潔凈室是指空氣潔凈度達(dá)到規(guī)定級(jí)別要求的可供人類工作的場(chǎng)所 ，其功能是控制微粒的污染 。一般按用途可分為：1.工業(yè)潔凈室，以無(wú)生命的微粒為控制對(duì)象；2.生物潔凈室，主要 控制微生物對(duì)工作對(duì)象的污染。

　　世界主要國(guó)家的潔凈室標(biāo)準(zhǔn)見表1^［6，7］。美國(guó)是世界上zui早頒布潔凈室標(biāo)準(zhǔn)的 國(guó)家，各國(guó)的潔凈室標(biāo)準(zhǔn)都是在美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合各國(guó)的實(shí)際情況而制訂的，我國(guó)的 標(biāo)準(zhǔn)基本上參照美國(guó)聯(lián)邦標(biāo)準(zhǔn)和歐共體的標(biāo)準(zhǔn)而制訂的。

　　3　潔凈室質(zhì)控的檢測(cè)方法及討論^［8］

　　3.1　塵埃粒子　由于空氣中存在大量塵埃粒子，而微生物大多依附于這些塵埃粒子隨空氣流動(dòng)造成污染。制 藥工業(yè)用多種方法獲得無(wú)菌狀態(tài)，過濾法以其捕集率高，又經(jīng)濟(jì)而被廣泛使用。其中，特別 應(yīng)該提到的是采用了HEPA（High Eicienoy Particulate Air）過濾器，對(duì)0.3μm以上空氣 粒子捕集率高達(dá)99.97%以上，除濾過病毒外，空氣中所有微生物顆粒可被濾除。因此， 正常潔凈室是無(wú)菌的，但是，由于人、物、環(huán)境等污染因素，潔凈室往往受到不同程度 污染。因此，我們多采用激光塵埃粒子計(jì)數(shù)且進(jìn)行監(jiān)控。標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2　國(guó)內(nèi)外有關(guān)懸浮粒子的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)（塵粒數(shù)/m³）

　　3.2　空氣微生物　空氣中活微生物大多依附塵埃粒子而形成生物活性粒子。應(yīng)用細(xì)菌采樣器抽取一定量的空氣 使其滯留在培養(yǎng)基上，經(jīng)過培養(yǎng)計(jì)數(shù)菌落數(shù)。早在現(xiàn)代微生物問世之前，人們就認(rèn)為某些疾 病是由被稱為“瘴氣”的空氣污染而引起。20世紀(jì)30年代，英國(guó)研制porton液體采樣器，美 國(guó)研制了AGI液體采樣器。1941年，Bourdion使用裂縫式采樣器，成為空氣微生物采樣測(cè)定 的開端。1956年，報(bào)道了*個(gè)篩孔撞擊式采樣器，1958年A.A.Andersn對(duì)其加以改進(jìn)并 定型生產(chǎn)，稱為安德森（Anderson）空氣微生物采樣器。它由頂罩、6節(jié)篩板、3個(gè)彈簧及抽氣 孔和動(dòng)力裝置構(gòu)成。目前，這種采樣器已發(fā)展到8級(jí)，并有許多改進(jìn)型。由于它采集粒譜廣 、效率高、生物失活率低等原因而廣泛使用至今。空氣微生物采樣器一般分為七大類：液體 式、固體式、沉降式、離心式、光散射式和大容量式。本文將對(duì)離心式空氣微生物采樣器（R CS）作詳細(xì)討論。空氣微生物測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3　國(guó)內(nèi)外有關(guān)空氣微生物的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)（CFU/m³）

　　 3.3　表面微生物　為了檢測(cè)潔凈室中墻壁、地板、儀器表面、桌 面、門把等帶菌情況，通常選用接觸壓印法（Cortact）和棉拭法（Swabbing）等方法。需要時(shí) ，還可與過濾裝置相結(jié)合來完成棉拭采樣。1941年，Walter和Hvcker報(bào)道了COntact瓊脂平 板方法，以后，Angelotti和Fotert等作了進(jìn)一步的工作。帶菌狀況都有要求，歐共體GMP（ 草案）規(guī)定，100級(jí)：平均菌落數(shù)不可超過5 個(gè)；1000級(jí)：25個(gè)；100000級(jí)：50個(gè)。表面微生物的檢測(cè)，越來越受到人們的重視。

　　3.4　關(guān)于沉降平皿（Settle plate）　1881年Kock創(chuàng)立。依靠空氣中的粒子自然沉降于瓊脂平板上的這種采集方法，由于粒子沉降 的速率很慢，如需采集到有效數(shù)量的粒子，就需暴露很長(zhǎng)時(shí)間。但因空氣中的致病菌數(shù)量是 很少的，金黃色菌菌球菌在醫(yī)院病房空氣中平均每140升才有一個(gè)活菌粒子，為了彌補(bǔ)這個(gè) 缺陷，曾采用直徑為14公分的大平皿，以增加瓊脂的暴露面積。Harding和Williams還曾用 一種多層平板的方法來進(jìn)一步暴露面積，每層放一個(gè)14公分直徑的平板，但結(jié)果不堪滿意。

　　奧姆梁斯基曾試圖把采樣后平板上長(zhǎng)出的菌落換算成一定體積空氣中的微生物含量，以便能 利用沉降平板法的采樣結(jié)果來測(cè)定空氣中的活菌濃度。為此，他設(shè)定了在100cm²營(yíng)養(yǎng)瓊脂 上暴露5分鐘后，培養(yǎng)長(zhǎng)出的菌落，即相當(dāng)于10升空氣中的活菌數(shù)。由于懸浮在空氣中的含 菌粒子直徑不超過100μm，這些小粒子在空氣中的沉降受空氣阻力的影響，其沉降速率遵循 上的Stokes公式。根據(jù)這個(gè)公式，粒子的沉降速率與其大小成正比，但是，奧姆梁斯基 恰好忽略了這一點(diǎn)，因此，它是不能成立的。例如，直徑1μm的含菌粒子，在5分鐘內(nèi)沉降 距離為1.05cm，大部分的粒子就沉降不到瓊脂表面上。

　　由于潔凈室已濾除了大部分大顆粒，一般用此法是無(wú)意義的。但是，人為、環(huán)境和潔凈裝置 故障等原因引起的較大顆粒污染以及沉降平板采樣潔的簡(jiǎn)便，可作為日常監(jiān)測(cè)潔凈室水平的 一種參考方法。

　　3.5　關(guān)于RCS^［9］　離心式空氣采樣器（The Reuter Centrifugal Sampler,RCS）被介紹作為一種在醫(yī)院使用的檢 測(cè)空氣微生物的儀器，由于它輕便，無(wú)噪音而廣泛使用，并擴(kuò)展到制藥工業(yè)等領(lǐng)域。RCS通 過離心收集顆粒，為制藥工業(yè)所接受，因?yàn)樗坪醴螰DA所描述的“Active”采樣儀器。 。Gre-schel等認(rèn)為它相當(dāng)有效，Macher等則持反對(duì)意見。多年來，許多研究者研究了帶菌 顆粒的大小，結(jié)論是：5-15μm，中等粒是13μm，而4μm以下很少。這些結(jié)果是從醫(yī)院、手 術(shù)室、辦公室、實(shí)驗(yàn)室和制藥無(wú)菌室所獲得。他們認(rèn)為，如果顆粒大小是已知的，RCS可定 量測(cè)定細(xì)菌濃度，但是，目前這些顆粒大小是未知的，故不能把它視為定量采樣器，只能歸 于沉降平皿一樣的類型。Delmore等發(fā)現(xiàn)，100級(jí)無(wú)菌室中，RCS/slit比率是2.1，即RCS是s lit采樣器微生物捕促率的210%有效。我國(guó)丁璽華等也仿制了RCS，選用國(guó)產(chǎn)元件，試制了LW C-1型離心式空氣采樣器。

　　雖然RCS有正反兩方面的爭(zhēng)議，但由于它有許多優(yōu)點(diǎn)，并明顯優(yōu)于沉降平皿，1986年，西方 近一半的制藥公司采用了RCS，作為空氣微生物采樣器，我國(guó)正在逐漸推廣。